自20世紀50年代，Watson和Crick提出經(jīng)典的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，DNA就成為了生命科學(xué)研究的核心。DNA中4種堿基的數(shù)目及其排列順序會導(dǎo)致基因的多樣性，其空間結(jié)構(gòu)也會影響著基因的表達。 圖片來源：攝圖網(wǎng) 除了傳統(tǒng)的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)在人類細胞中還存在著一種特殊的四鏈DNA結(jié)構(gòu)——G-四鏈體。G-四鏈體（G-quadruplex）是由富含串聯(lián)重復(fù)鳥嘌呤（G）的DNA或RNA折疊形成的高級結(jié)構(gòu)，在迅速分裂的細胞（例如癌細胞）中G-四鏈體的含量特別高。因此，G-四鏈體可作為抗癌研究中的藥物靶點。研究G-四鏈體的結(jié)構(gòu)及其與結(jié)合劑的結(jié)合模式，對于癌細胞的診斷與治療具有重要的意義。 G-四鏈體的三維結(jié)構(gòu)示意圖。圖片來源：wikipedia 電子-電子雙共振技術(shù) 脈沖偶極電子順磁共振（Pulsed Dipolar EPR，PDEPR）方法已經(jīng)發(fā)展成為結(jié)構(gòu)和化學(xué)生物學(xué)中可靠和通用的結(jié)構(gòu)測定工具，通過PDEPR技術(shù)可在納米尺度上提供距離信息。在G-四鏈體結(jié)構(gòu)研究中，使用電子-電子雙共振（electron-electron double resonance，DEER）技術(shù)結(jié)合定點標記（site-directed spin labeling，SDSL）技術(shù)可區(qū)分不同長度的G-四鏈體二聚體并揭示G-四鏈體結(jié)合劑與二聚體的結(jié)合模式。 利用DEER技術(shù)區(qū)分不同長度的G-四鏈體二聚體 使用Cu(pyridine)4作為距離測量的自旋標記，將四方平面Cu(pyridine)4復(fù)合物與G-四鏈體共價結(jié)合，通過檢測偶極-偶極相互作用測量π-堆疊的G四元單體中兩個順磁Cu2+之間的距離，從而研究二聚體的形成。 [Cu2+@A4]（TTLGGG）與[Cu2+@B4]（TLGGGG）為兩種具有不同序列的寡核苷酸，其中，L表示配體。圖1和圖2為[Cu2+@A4]2和[Cu2+@B4]2的DEER實驗結(jié)果，從DEER結(jié)果中可得到[Cu2+@A4]2二聚體中，單個Cu2+-Cu2+的平均距離dA=2.55 nm，G-四鏈體3′端通過尾尾疊加形成G-四鏈體二聚體，且G-四鏈體二聚體中兩個Cu2+自旋標簽的gz軸平行排列。 與[Cu2+@A4]2二聚體相比，[Cu2+@B4]2π堆積距離比 [Cu2+@A4]2二聚體長（dB-dA= 0.66 nm），證實了每個[Cu2+@B4]單體含有一個額外的G四分體，這個結(jié)果與預(yù)期距離充分一致。因此，通過DEER技術(shù)進行距離測量，可區(qū)分不同長度的G-四鏈體二聚體。 圖1 (A) [Cu2+@A4]2二聚體的脈沖EPR微分譜(黑線)及其對應(yīng)的模擬(紅線) (34 GHz，19 K); (B)背景校正后在a-d四個場位置的DEER時域圖(黑線)及從PeldorFit獲得的較佳擬合結(jié)果(紅線); (C)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的距離分布; (D) [Cu2+@A4]單體和[Cu2+@A4]2二聚體之間的平衡。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947) 圖2 (A)[Cu2+@B4]2背景校正后在a-d四個場位置的DEER時域圖(黑線)及從PeldorFit獲得的較佳擬合結(jié)果(紅線); (B)[Cu2+@B4]的結(jié)構(gòu)示意圖; (C)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的距離分布。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947) 利用DEER技術(shù)探究G-四鏈體結(jié)合劑與二聚體的結(jié)合模式 許多小分子和金屬配合物，具有平面芳香大共軛體系且?guī)д姾桑梢越Y(jié)合并穩(wěn)定折疊的二級結(jié)構(gòu)，從而成為潛在的抗癌藥物。 N,N ' -雙[2-(1-哌啶基)乙基]3,4,9,10-苝四羧基二酰鹽酸鹽（PIPER）就是一種著名的G-四鏈體結(jié)合劑，可通過堆積作用與四鏈體結(jié)合并穩(wěn)定四鏈體，通過DEER技術(shù)可探究PIPER與G-四鏈體的結(jié)合模式。 圖3與圖4為不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER實驗結(jié)果。結(jié)果顯示，當PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例為1：1時（PIPER@[Cu2+@A4]2），dP= 2.82 nm。 與純[Cu2+@A4]2二聚體（dA= 2.55 nm）相比，Cu2+-Cu2+之間距離增大，說明了PIPER與二聚體形成了三明治復(fù)合物，平面有機分子插在兩個G四聯(lián)單體的3′面之間。當PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例為2：1時（2PIPER@[Cu2+@A4]2），d2P= 3.21 nm。 與PIPER@[Cu2+@A4]2二聚體（dP= 2.82 nm）相比，多了一個π堆積的距離，說明兩個PIPER配體插入到尾對尾排列的G四鏈二聚體中。通過DEER技術(shù)可揭示G -四鏈體結(jié)合劑PIPER插入G-四鏈體二聚體中形成夾層復(fù)合物的新結(jié)合模式。 圖3 (A)含有不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER偶極譜(geff=2.061); (B)含有不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER調(diào)制深度;(C)[Cu2+@A4]2二聚體和PIPER@[Cu2+@A4]2、2PIPER@[Cu2+@A4]2、PIPER@[Cu2+@A4]的平衡。 (Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947) 圖4 (A)PIPER@[Cu2+@A4]2的DEER時域譜;(B)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的PIPER@[Cu2+@A4]2距離分布; (C)2PIPER@[Cu2+@A4]2的DEER時域譜; (D)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的2PIPER@[Cu2+@A4]2距離分布。 (Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947) 國儀量子脈沖式電子順磁共振波譜儀 國儀量子脈沖式電子順磁共振波譜儀EPR100支持電子-電子雙共振技術(shù)，可用于研究復(fù)雜膜蛋白、DNA、RNA、核酸蛋白復(fù)合體以及在各種疾病中產(chǎn)生關(guān)鍵作用的相關(guān)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)定位、功能解釋、生理運動過程以及作用機理解釋。 國儀量子X波段脈沖式電子順磁共振波譜儀EPR100 國儀量子EPR100的DEER實驗結(jié)果 使用DeerAnalysis處理后的實驗結(jié)果